精准医疗，靶向治疗，基因检测，复发难治的骨肉瘤…这是近年我们在临床常常听到的词汇，他们到底是什么，和我们治疗有什么关系，作者通过此文向大家简要介绍一下这些概念，以及目前这些手段是如何应用在临床治疗中的。
目前FISH，基因芯片，免疫组化，一代、二代测序（外显子测序，DNA测序，RNA测序）等在肿瘤治疗中越来越多的被大家应用，用来更为广泛深入的对肿瘤组织进行分子特征分析（molecular profiling），希望通过这一过程找到针对性更强的治疗药物，以提高肿瘤治疗效果，特别是常规治疗失败的肿瘤的治疗效果。在一些肿瘤如肺癌、乳腺癌、结直肠癌等领域取得了一些突破性进展，但在异质性很强的肉瘤治疗中，这一方法是否能够发挥积极的作用有待验证。北京大学人民医院骨肿瘤科姬涛
目前国内一线的肉瘤治疗逐渐规范，基本上大的骨与软组织肿瘤治疗中心使用的方案都与国际接轨，治疗效果相似，但对于复发转移的肉瘤，不同医院方案差异很大。随着二代测序的出现，临床医生也尝试利通过对患者标本进行检测，以期找到可以治疗的靶点，解决临床难题。相对于Sanger测序，二代测序（NGS）拥有高通量和低单碱基成本的特点，这使其在临床检测领域拥有得天独厚的优势。相较于原有检测方法，其复杂程度大大提高，因此需要一个规范标准来指导实验室进行检测。美国病理学会（CAP）于2011年成立了NGS工作部门，列出共计18条实验室要求的检查表NGS包含两个部分：实验操作部分（wet bench）和生物信息分析部分（dry bench）。二代测序（NGS）应用于临床需要有严格的指控，首先样本的肿瘤含量，其次DNA和RNA检测对标本的要求完全不同，再有NGS的分析结果十分依赖生物信息学的合理使用。此外，在临床制定个体化治疗方面应当结合多种检查方法，互相印证，在多水平（DNA，RNA和蛋白）进行分析，充分发挥各种方法的优势，DNA突变不一定带来有意义的通路变化，功能蛋白的变化，所以就需要核苷酸序列分析和蛋白检测相结合，并且核苷酸水平需要测序和FISH联合，全基因组测序和Penal结合等方法，一方面提高检测准确性，另一方面更为准确地揭示肿瘤从遗传到功能的特点。
下面通过近期美国著名肿瘤中心MD Anderson发表的一篇相关文章介绍这一方面进展，给大家一个直观概念，抛砖引玉，使大家对这方面有一个直观的了解。
2015年10月15日在Oncotarget上发表的《肿瘤分子检测在高危骨肉瘤个体化治疗中的应用-精准医疗的现状和局限》介绍了美国著名肿瘤中心MD Andeson在骨肉瘤个体化治疗方面的应用情况。
【摘要】
背景：尽管近几十年分子水平医学研究取得了显著的进展，但在骨肉瘤的治疗进展很有限。我们对两例转移和化疗后复发的难治性骨肉瘤患者进行详细的肿瘤分子学检测，希望通过针对性更强的分子水平的靶向治疗（Targeted Therapy）使患者受益。
材料方法：通过从两例复发和转移的骨肉瘤患者肿瘤标本中取得>50ng的DNA进行分子检测，检测包括>300个基因的目标基因检测，28个常见的重排或突变的内含子检测。每一个样品均达到测序深度和覆盖最高。同时除了原位荧光杂交（FISH）外，也进行了免疫组化和蛋白组学检测。所有检测均在CLIA认证的实验室进行，根据检测结果选择靶向治疗方案（Targeted Therapy）。通过QIAGEN公司的Ingenuity Pathway Analysis平台进行检测后生物信息学分析。
结果：一位患者外显子二代测序提示MET扩增，PI3K突变，CCNE1扩增，PTPRD突变，免疫组化的蛋白组学检测提示c-met表达（受体tyr1234 / 1235磷酸化）和mTOR／Akt信号通路活化（IGF-1R（tyr1165 / 1166磷酸化），p-mTOR（ser2448磷酸化），p-Akt（Ser473磷酸化），SPARC和COX2表达。基于上述结果，靶向治疗包括PIK3CA、c-met、SPARC和COX2，方案为西罗莫司+克唑替尼，治疗ABRAXANE （是一种人类蛋白、白蛋白结合型紫杉醇，作者注）+塞来昔布（西乐葆）。另一位患者：基因突变变异包括NF2外显子2-16删失，PDGFR-alpha扩增和TP53突变。这名患者被纳入了一项临床试验，实验方案为替西罗莫司，索拉非尼和贝伐单抗，药物分别针对NF2，PDGFR-alpha和TP53突变。两位患者均未从治疗中获益。
结论：复发性骨肉瘤的特点是复杂信号通路调控和耐药。更为详细的分子检测对于肿瘤的个体化治疗提供了可能。随着检测手段的逐渐进步，可以使我们更好地利用检测为临床治疗决策提供参考，这方面的研究是十分必要的。
骨肉瘤是儿童及青少年最常见的原发恶性肿瘤。它包括一组以肿瘤性成骨为特点的间叶恶性肿瘤，有不同的病理亚型，包括骨母细胞型、软骨母细胞型、纤维母细胞型和非经典型。骨肉瘤的生物学特性十分复，杂治疗方案在过去的30年中没有本质的变化。自上世纪80年代以来，原发性骨肉瘤的首选治疗方案包括术前化疗，手术。术后一般维持化疗。对于局部复发和远处转移的骨肉瘤患者来说可以选择的治疗方案十分有限。最近一项联合应用索拉非尼和依维莫司的二期临床研究是近几十年中第一项有阳性结果的针对复发或转移骨肉瘤方面的临床试验，但这一研究依然没有达到统计学差异（The Lancet Oncology, 2015;16:98-107）。镭-233氯化物，一种alpha射线，可能是骨母细胞型骨肉瘤患者潜在的治疗药物。
在精准医疗的时代，患者肿瘤标本的分子检测可以很方便的明确，并可以实时匹配相对应的靶向药物。这种方法使得针对肿瘤的全面系统性检测成为可能，并可以依据这一结果提出个体化治疗方案。由于现有治疗方法对于复发或转移骨肉瘤患者的治疗效果很差，这些患者很有可能从深度测序，肿瘤基因组分析和系统的分子分析获得治疗方面的受益。基于此，我们对两位骨肉瘤转移的患者进行了分子检测，并进行匹配的靶向治疗，再次我们介绍治疗情况并讨论分子检测在骨肉瘤治疗方面的价值和局限。
第一位患者：
21岁的男性患者，2011年诊断为右股骨远端软骨母细胞型骨肉瘤。诊断后，他开始接受标准的一线治疗，术前接受了MAP化疗，阿霉素顺铂化疗后疼痛明显缓解。之后进行了保肢手术，病理检查提示肿瘤坏死率80%。患者术后完成常规的化疗方案。化疗结束后9个月，常规CT检查发现左上肺一个3.5X87.5px的结节，右肺中叶一个2.0X62.5px的结节，提示肿瘤远处转移。之后患者接受了大剂量异环磷酰胺治疗（14g/m2），之后疾病仍持续进展，病人随后出现自发性气胸。之后继续给予顺铂和阿霉素化疗，虽然气胸好转，但肿瘤持续进展，患者之后接受了左上肺叶切除，病理显示左上肺叶有40个转移灶。之后对转移灶进行分子检测，明确是否有潜在的靶向治疗靶点。患者被转诊到分子治疗研究组。
基于二代测序（外显子测序）结果的分析和治疗：
由FoundationOne进行的二代测序发现四个基因变异：MET扩增，PIK3CA V334G突变，CCNE1扩增，和无功能的PTPRD（s1845f *）突变。MD Anderson的46-基因Panel确认了PIK3CA V344突变。Caris公司检测结果提示TLE3阳性（2+，80%），雄激素受体阳性（1+，60%），TS，RRM1，PTEN阳性。进一步检测提示ERCC1，MGMT，TOPO1，ER/PR和SPARC阴性。FISH检测结果提示HER2/neu和TOP2A未扩增。热点测序结果提示PIK3CA和BRAF为野生型，未见突变。
基于免疫组化的蛋白组学分析和治疗：
基于免疫组化的蛋白组学分析提示肿瘤细胞c-Met通路轻度活化，细胞浆c-Met磷酸化（Tyr1234 / 1235）（0到1+，少量2+，染色体显色信号0至3+）。胰岛素样生长因子（IGF）通路胞浆内IGF-1R（Tyr1165 / 1166）1+至 3+。此外，PKCα中度表达（细胞浆内3+）。ras / Raf激酶的胞外信号调节激酶（ERK）通路也是活化的（p-ERK 1/2（Thr202/Tyr204））。此外，雷帕霉素的哺乳动物靶点C2（mTORC2）也有所表达，p-mTOR（ser2448）和其上游的p-AKT（Ser473）都有磷酸化。mTORC2活化是IGR-1R通路和PKC-alpha强表达共同的结果。
根据分子检测结果通过IPA平台分析生物通路网络，并明确潜在的靶向治疗靶点，检查结果提示6个通路活化，但通过与患者正常组织对照，只有一条通路为患者肿瘤组织特有的活化。在该患者中，参与控制胰岛素和卵泡刺激素相互作用的通路失活，并且与MYC有相互作用，MYC是癌症的一个关键转录调控因子。在通路分析上，PROP1潜在存在着最广泛的影响，这可能会降低β-catenin水平（CTNNB1）。PROP1在垂体表达一种转录因子。基于上述结果，七种可以考虑的药物包括：1，25双羟维生素D3、塞来昔布、吉西他滨、洛伐他汀、褪黑素，二甲双胍和ab-paclitaxel（蛋白结合型紫杉醇）。这些药物可以覆盖患者肿瘤组织异常的。鉴于PIK3CA 的V344G突变，该患者开始二甲双胍和雷帕霉素的治疗。疾病稳定被认为是治疗有效的指标，外显子测序结果中的c-Met基因扩增被免疫组化证实，所以患者也接受了克唑替尼的治疗，该药是一种c-Met/ALK和ROS1的抑制剂。在接受克唑替尼+雷帕霉素+二甲双胍的治疗时，肿瘤仍然进展。当时该患者考虑接受另一种c-Met更强的抑制剂治疗，但该临床试验需要4周的空白期，所以该患者接受了吉西他滨和紫杉醇治疗（蛋白组学提示的SPARC表达）。同时治疗中也加上了塞来昔布（IHC提示COX2表达），但患者的肿瘤持续进展，最后死于广泛转移。
另一位患者：
患者为16岁男性，左胫骨近端骨肉瘤。活检明确为骨母细胞型骨肉瘤，患者接受新辅助化疗，根据AOST0331方案给予MAP化疗，但是患者并没有正式进入临床试验。患者接受了旋转成型手术，术后肿瘤坏死率为95%，切缘阴性。术后继续MAP方案治疗，随后患者出现双髋及腹股沟区疼痛，并且对保守治疗无效。左髋MRI提示肿瘤转移，活检提示骨肉瘤，患者开始接受脂质体阿霉素+大剂量甲氨蝶呤和唑来膦酸治疗，复查PET提示左髋左股骨病变。之后该患者转诊到MD Anderson接受镭-223临床试验（NCT010833520）。初次治疗后肿瘤仍然进展，之后接受两个疗程的异环磷化疗，但肿瘤持续进展，患者随后接受左大腿截肢术。
基于二代测序（外显子测序）结果的分析和治疗：
该患者基因检测结果提示NF2基因外显子2C16损失，PDGFRA扩增，c17orf39扩增，RB1和TP53删失。患者的未知基因变异检测提示以下突变：CUX1 l509V，GPR124 A1090P，RAD50V842A，FANCD2扩赠，HGF R328H，VHL扩增，FGF14重排，IL7R E392K，FLCN扩增，PCLO P1027T。IHC证实PDGFR扩增，病理切片提示90% PDGFRA阳性（90%肿瘤细胞3+）。
该患者在MD Anderson分子治疗讨论会上进行治疗计划。根据分子检测结果，该患者被纳入一个I期临床试验（NCT01187199），贝伐单抗+替西罗莫司联合索拉菲尼，用于治疗晚期肿瘤。病人对治疗耐受较好，仅表现为2级黏膜炎和1级疲劳。再次评估时提示双肺多发FDG摄取，提示肺部转移，此外还有骨转移。由于肿瘤进展迅速，临床试验提前终止，患者接受支持对症治疗。
临床应用二代测序和免疫组化的蛋白组学有着自身的局限性，首先，骨肉瘤是突变累及导致肿瘤。这些突变中只有TP53是明确已知的，一项对123例骨肉瘤进行DNA测序的研究发现TP53和RB1基因突变的比例为47%。但TP53目前是无法进行靶向治疗的。第二，患者在化疗失败后给予靶向治疗，这时的肿瘤一般处于耐药状态并且生物学十分复杂。第三，有一些靶点目前没有匹配的药物，如WNT通路的抑制剂，Gli2相关通路的抑制剂。第四，肿瘤内和肿瘤间的异质性明显。转移部位的肿瘤较原发灶及复发灶有着不同的肿瘤生物行为学。最后，最近的一项研究表明，在上市的靶向治疗药物适应症以外使用，效果十分有限，很难提高非适应症的治疗效果。可能是没有在正确的时间，针对合适的靶点采用恰当的药物，单TKI可能只在一小部分肿瘤发挥作用。此外，大部分肿瘤受控于复杂的细胞水平的通路网络，需要在更为合适的模型上进行研究，如在人源性异种移植动物模型和共培养技术研究激酶组学，蛋白质组学和药物筛选，而不仅限于NGS和免疫组化。此外，和国外相比，我国在这方面还相对落后，特别是临床医生、病理医生对于这些技术的认识水平还有待提高，如何更为合理地，理性地应用检查结果需要进一步提高，完善“分子治疗查房”机制，提高这方面的治疗水平。
有关骨肿瘤治疗分子检测及治疗方案可以到北京大学人民医院（白塔寺院区）骨肿瘤化疗门诊咨询，门诊时间周一至周五下午2:00-4:00。
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