摘 要 目的：探讨P-gp在骨肉瘤组织中的表达，以及于LRP、bcl-2蛋白的相关性。方法：用免疫组化方法检测了42例骨肉瘤组织中P-gp, LRP, bcl-2的表达。结果：29例获得平均1年8个月的随访，复发5例，肺转移16例(其中8例死亡)。P-gp的表达率为35.71%，与预后有关。P-gp和LRP表达具有相关性；P-gp与bcl-2的表达之间均无相关性；三者的表达与年龄、性别、分型及Enneking分期无关。结论：P-gp和LRP的表达是骨肉瘤多药耐药性的重要因素，并影响患者的预后。东营市人民医院脊柱外科刘玉军
关键词 骨肉瘤；P-糖蛋白；肺耐药蛋白；bcl-2蛋白； 免疫组化
Expression of P-gp in osteosarcoma and Correlation with the Expression of LRP、bcl-2//LIU yu-jun, LUO-xiangtian GUO shu-fang ,, et al. Department of Orthopaedics, Hekou Hospital, Dongying, Shandong 257200
Abstract Objective: To investigate the expression of P-gp, in osteosarcoma and the with the expression of the LRP 、bcl-2 protein. Methods: The expression of P-gp, LRP and bcl-2 was investigated by SABC immunohistochemical staining in 42 patients with osteosarcom. Results: 29 case were followed-up with the average time of 1 year 8 months, there were 5 case in recurrent and 16 case in lung metastasis (8 death among them). The positive expression rate of P-gp, 35.71%, and no correlation with clinical-factor, and related with the prognosis, There was a high correlationship between P-gp and LRP expression , no relationship between P-gp and bcl-2, LRP and bcl-2 expression. Conclusion: The expression of P-gp was an important factor of exsisting multidrug resistance in osteosarcoma, and influnencing the prognosis.
Key words Osteosarcoma ; P-gp; LRP; bcl-2; Immunohistochemistry
化疗耐药是导致骨肉瘤治疗失败的主要原因之一,与多种耐药相关基因有关。本研究应用免疫组织化学的方法检测骨肉瘤组织中P-糖蛋白(P-gp)的表达分析其与骨肉瘤预后的关系并同期测定LRP及bcl-2的表达，探讨与P-gp表达的关系。
1 材料与方法
1.1 临床资料
本组男27例，女15例；年龄10~55岁，中位年龄24岁。股骨21例，胫骨12例，肱骨9例。所有病人术前均未行化疗。术式例数：截肢或关节离断术22例，瘤段切除假体置换术11例，扩大切除术8例，肌皮瓣转位术1例。组织学分型按Dahlin’s分型方法进行分类。29例获得了平均1年8个月(6个月~3年9个月)的随访并进行了Enneking分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期15例，Ⅲ期12例。
1.2 标本选择
所有标本均经病理证实常规固定，石蜡包埋。连续切片，厚5μm，待检。
1.3 免疫组化试剂
所有免疫组化试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司，Ⅰ抗均为美国Santa Cruz公司产品。染色采用SABC法。用已知肿瘤组织阳性片作阳性对照，用PBS代替Ⅰ抗作阴性对照。
1.4 结果的判断
P-gp阳性结果主要位于胞浆中，部分位于细胞膜，LRP阳性表达位于胞浆中， bcl-2的阳性产物主要位于胞浆；均以出现棕色颗粒为阳性。每张切片连续计数200个肿瘤细胞，阳性细胞数小于5%为阴性，阳性细胞数大于5%为阳性。
1.5 统计学处理用X2检验。
2 结果
2.1 P-gp在骨肉瘤中的表达
本组P-gp阳性15例，阳性表达率为35.7%，P-gp表达与患者的年龄、性别、Dahlin's分型和Enneking分期均无关(P>0.05)，见表1。在随访的29例中，16例为阳性表达，仅有1例预后良好；阴性表达的13例中，9例预后良好，经统计学分析预后不良组的阳性率(77.8%)明显高于预后良好组(18.2%)，见表2。
2.2 LRP、bcl-2在骨肉瘤中的表达
本组LRP阳性表达率为42.86%，bcl-2阳性表达率52.38%。两者的表达与年龄、性别、Dahlin's分型和Enneking分期均无关，见表1。两者在骨肉瘤中的表达无相关性；LRP、bcl-2的表达与预后密切相关，并且两者在骨肉瘤中的表达呈明显的一致性，见表2。
2.3 P-gp表达与LRP、bcl-2表达之间的关系。
P-gp和LRP同时呈阳性表达13例，P-gp和bcl-2同时呈阳性表达14例，三者同时阳性表达者4例；P-gp和LRP之间具有相关性；而P-gp和bcl-2之间没有相关性，见表2。
表1 骨肉瘤P-gp、LRP与bcl-2的表达与临床病理的关系
临床病理
例
数
年龄(岁)
＜24
23
9
14
＞0.05
9
14
＞0.05
12
11
＞0.05
≥24
19
7
12
9
10
10
9
性 别
男
27
11
16
＞0.05
10
17
＞0.05
15
12
＞0.05
女
15
5
10
8
7
7
8
Dahlin分型
骨母细胞型
17
6
11
＞0.05
9
8
＞0.05
10
7
＞0.05
软骨母细胞
12
4
8
5
7
4
8
纤维母细胞
10
5
5
3
7
6
4
其 他
3
1
2
1
2
2
1
Enneking分期
Ⅰ~Ⅱ
17
7
10
＞0.05
8
9
＞0.05
7
10
＞0.05
Ⅲ
12
5
7
6
6
6
6
表2 P-gp表达与预后、LRP、bcl-2的的关系
P-gp表达
阳性率(%)
P－
＋
预后
良好
9
2
18.2
不良
4
14
77.8
＜0.05
LRP
－
8
7
46.7
＋
14
13
48.1
＞0.05
bcl-2
－
10
6
37.5
＋
12
14
53.8
＞0.05
3 讨 论
P-gp是多药耐药基因(MDR)编码的蛋白质，它在多种人类恶性肿瘤中均有高表达。目前有关骨肉瘤中P-gp表达的研究尚有分岐。Hornicek[1]等用免疫荧光的方法对40例骨肉瘤患者进行了研究，结果显示P-gp的表达能预测ⅡB骨肉瘤患者的生存时间的长短。Serra[2]等也指出P-gp蛋白水平的增高、肿瘤体积＞150ml、年龄＜12岁，均为复发的高危险因素。于秀淳等[3]用免疫组化的的方法检测了33例骨肉瘤中P-gp的表达，结果阳性表达率为45.5%，证实P-gp的表达是骨肉瘤产生耐药的重要因素，并影响患者的预后，但P-gp的表达与骨肉瘤的临床因素间无明显相关性。本组应用免疫组化的方法，结果发现42例骨肉瘤中，15例P-gp阳性表达，阳性表达率为(35.71%)，并且P-gp的表达患者的预后有关，这与上述结果相似。另有研究表明P-gp的表达不能作为骨肉瘤耐药的指标。Kumta[4]等对45例骨肉瘤患者进行了平均14个月的随访研究，结果示P-gp的表达与化疗后的肿瘤坏死率无关。Pakos[5]等的研究表明P-gp的表达与联合化疗后的肿瘤组织学变化无关。这说明MDR影响骨肉瘤预后的原因不单纯是由于肿瘤细胞产生耐药引起的，尚存在其他机制。
关于骨肉瘤中P-gp表达与LRP、bcl-2的相关性研究，目前尚报道很少。刘国艳[6]等的研究中发现P-gp与LRP在卵巢癌中的表达无相关性，本研究发现LRP与P-gp表达具有相关性，表明LRP在骨肉瘤中具有介导多药耐药的作用。
bcl-2是一种凋亡抑制基因，研究证明，在恶性骨肿瘤复发后P-gp、bcl-2的表达均有增强的趋势[7]。本研究中，bcl-2蛋白和P-gp蛋白的表达无明显相关性。此外P-gp LRP、bcl-2同时表达阳性者共4例，占13.8%，P-gp和LRP同时呈阳性表达13例，占44.9%，P-gp和bcl-2同时呈阳性表达14例，占48.3%。表明骨肉瘤的耐药及预后与多种基因的异常表达有关，它们有的联合发挥作用，有的独立起作用。
应用免疫组化检测肿瘤细胞中耐药性相关蛋白简便、客观、经济，可应用临床预测化疗的敏感性和判断患者的预后。
参 考 文 献
〔1〕 Hornicek FJ, Gebhardt MC, Wolfe MW, et al. P-glycoprotein levels predict poor outcome in patients with osteosarcoma. Clin Orthop[J], 2000, 373(1): 11~17.
〔2〕 Serra M, Scotlandi K, Reverter-Branchat G, et al. Value of P-glycoprotein and clinico-pathologic factors as the basis for new treatment strategies in high-grade osteosarcoma of the extremities. J Clin Oncol[J], 2003, 21(3): 536~542.
〔3〕 于秀淳, 刘晓平, 曲在屏, 等. P糖蛋白在骨肉瘤组织中的表达及与PCNA、P53、nm－23蛋白表达的相关性. 中国矫形外科杂志[J], 2000, 7(3): 224~226.
〔4〕 Kumta SM Zhu QS, Lee KM, et al. Clinical significance of P-glycoprotein immunohisto-chemistry and doxorubicin binding assay in patients with osteosarcoma. Int Orthop[J], 2001, 25(5): 279~282.
〔5〕 Pakos EE, Ioannidis JP. The association of P-glycoprotein with response to chemotherapy and clinical outcome in patients with osteosarcoma. A meta-analysis. Cancer[J], 2003, 98(3): 581~589.
〔6〕 刘国艳, 吴小华, 宋俊芬, 等. 卵巢上皮癌组织中LRP和P-gp表达及其临床意义. 实用癌症杂志[J], 2001, 16(2): 144~146.
〔7〕 于秀淳, 刘晓平, 周 银, 等. P170、bcl-2在复发性骨肿瘤中的表达. 中国矫形外科杂志[J], 1999, 6(8): 575~577.