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非结核分枝杆菌的检查方法主要是依靠实验室检查，检查技术包括涂片检查，分离培养后进行鉴定及药敏试验、分子诊断技术等。 标本来自肺内和肺外，如痰液、支气管冲洗液、支气管肺泡灌洗液，肺、淋巴结、肝脏、肾脏和脾脏活检组织，血液、骨髓分泌物，体液和粪便等标本均可进行非结核分枝杆菌的检测。但不同临床标本所分离培养到的菌株临床意义有所不同，来自血液、淋巴结、骨髓、肝脏、肾脏和脾脏等的标本分离到的菌株往往意味着致病菌。而痰液、诱导痰、支气管冲洗液等呼吸道标本分离的菌株要排除标本污染或呼吸道定植的可能，因此需要留取多份标本。不同标本不能在同一天采集，不应使用口咽拭子培养或血清学检测结果来诊断非结核分枝杆菌病。 如果考虑是非结核分枝杆菌病，在留取标本期间要避免服用抗菌药物，尤其是大环内酯类、喹诺酮类、氨基糖甙类、磺胺类等药物，如果患者正在使用这些药物，建议必要时要停药至少2周再去采集标本。