在新生儿出现败血症后，可以进行细菌学检查进行确诊，包括血培养、脑脊液、尿培养、病原菌抗原及DNA检测等，而且血培养阳性是诊断新生儿败血症的金标准。

1、血培养：应在使用抗生素之前进行，抽血时必须严格消毒。疑为肠源性感染者应同时进行厌氧菌培养，以提高阳性率，且检出率一般较高；

2、脑脊液、尿培养：脑脊液除培养之外，还应制作涂片找寻细菌。尿培养最好从耻骨上膀胱穿刺来抽取尿液，以免发生污染，尿培养阳性有助于进行诊断；

3、病原菌抗原及DNA检测：采用对流免疫电泳、酶联免疫吸附试验等方法，用已知抗体测血、脑脊液和尿中未知致病菌抗原。还可采用DNA探针等分子生物学技术协助诊断。

此外，还可酌情行胃液和外耳道分泌物(应在生后1小时内)、咽拭子、皮肤拭子脐残端、肺泡灌洗液(气管插管患儿)等细菌培养，阳性可证实有细菌定植，但不能确立败血症的诊断。