苯丙酮尿症的常用诊断方法有新生儿疾病筛查、苯丙氨酸浓度测定，以及尿蝶呤图谱分析等。如果疾病能早期发现、早期诊断，并早期治疗，对提高患儿生活质量有重要帮助。

1、新生儿疾病筛查：新生儿哺乳3-7天，针刺足跟采集外周血，滴于专用采血滤纸上，晾干后即寄送至筛查实验室，进行苯丙氨酸浓度测定，如苯丙氨酸浓度大于切割值，应进行进一步检查和确诊；

2、苯丙氨酸浓度测定：正常浓度<120μmol/L(2mg/dl),经典型苯丙酮尿症>1200μmol/L；中度苯丙酮尿症＞360μmol/L-<1200μmol/L；

3、尿蝶呤图谱分析：主要用于BH4缺乏症的鉴别诊断。尿蝶呤谱采用高压液相(HPLC)分析尿中新蝶呤(N)和生物蝶呤(B)。如因6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏所致的BH4缺乏症尿中新蝶呤明显增加，生物蝶呤极低，尿蝶呤图谱分析显示异常者需进一步确诊。

此外，还有DHPR活性测定、DNA分析等检查方法。通常专业医生根据患儿智力落后、头发由黑变黄、特殊体味，以及血苯丙氨酸升高，同时排除四氢生物蝶呤缺乏症，就可以确诊苯丙酮尿症。