摘 要 目的：探讨非小细胞肺癌神经内分泌分化的免疫组化诊断。方法：选择三种神经内分泌共同标记cga、syn、ncnm，应用免疫组化lsab法，观察它们在nsclc中的表达。结果：在163例nsclc中，18例(11.04％)表达cga，63例(38.65％)表达syn，40例(24.54％)表达ncam。77例(47.24％)nsclc至少有1种ne标记表达，其中40例只表达1种标记，30例表达2种标记，仅7例3种标记均表达。3种标记表达彼此相关(p<0.005)，但存在差异(p<0.005)。与腺癌相比，腺鳞癌、鳞癌、大细胞癌染色阳性率较低。结论：选择3种ne标记可以检测出nsclc的ne分化，但不能以某一种标记的表达与否作为nsclc的ne分化诊断，应联合检测以至少2种标记表达定义为ne分化，在不同类型的nsclc中腺癌更易出现ne分化。

关键词：非小细胞肺癌 神经内分泌 分化 免疫组织化学 神经细胞粘附分子 突触素 嗜铬蛋白a
越来越多的研究显示非小细胞肺癌(nsclc)存在明显的异质性，出现与小细胞肺癌(sclc)、类癌(tc)相似的神经内分泌(neuroendocrine ne)分化,通过电镜观察胞浆内出现特异性致密核心颗粒(dcg)，但其在日常的病理诊断中受到一定限制。本研究应用免疫组化lsab法选择3种当前认为特异性和敏感性较好的ne标记嗜铬蛋白a(cga)、突轴素(syn)、神经细胞粘附分子(ncam)，研究它们在nsclc中的表达并探讨nsclc伴ne分化的诊断。
1．材料和方法
1.1 临床资料
本研究资料来源于我院1989年1月至1989年8月间接受外科切除的ⅰ～ⅲansclc病人，共计163例，全组平均年龄56岁(范围27～73岁)，男性131例(80.37％)，女性32例(19.63％)，病程0～48月，中位病程2月，右肺癌88例(53.99％)，中央型病变38例(23.31％)。按国际tnm分期，t1、t2、t3分别为11.04％、60.74％、28.22％；n0、n1、n2分别为60.74％、15.95％、23.31％；ⅰ期76例(46.63％)，ⅱ期18例(11.04％)，ⅲa期69例(42.33％)。行单叶、双叶和全肺切除分别为68.71％、15.95％和15.34％。
1.2 病理学分类
根据病理报告，复习原病理切片，获得原发肿瘤有代表性即癌组织较集中，坏死组织最少的福尔马林固定石蜡包埋的组织块，重新切片he染色，根据1982年who肺癌组织学分类标准行病理诊断。全组鳞癌76例(46.63％)，腺癌62例(38.04％)，腺鳞癌21例(12.88％)，大细胞癌4例(2.45％)，在腺癌中腺泡性腺癌、乳头状腺癌、细支气管肺泡细胞癌、实体癌伴粘液形成分别为31例、19例、8例、4例。大部分肺癌呈中、低度分化。
1.3 免疫组化(ihc)
连续切片4张，厚4μm，一张he染色用，余供免疫组化用。采用slab法测定cga、syn、ncam的表达。抗cga(dak-a3)单抗(dako公司)、抗syn多抗(dako公司)及抗ncam(123c3)单抗(monesan公司)的工作浓度分别为1∶100、1∶100、1∶50，k681通用型lsab试剂盒亦由dako公司提供。实验中应用微波处理抗原恢复。以已知阳性的sclc与tc切片为阳性对照，并以切片中出现的神经为阳性内对照，已知阳性切片以pbs代替ⅰ抗进行空白对照，实验中选择同期13例sclc、7例tc以评价ⅰ抗的染色效果。ihc结果通过光镜观察判别，记录染色细胞百分比与染色强度(0～3级)，因为sclc和tc中阳性染色可见胞膜和/或胞质呈现明显特异性棕黄色颗粒，在nsclc染色强度ⅰ级有时很难与背景染色区分，不同人不同期的观察也会有不同的结果。因此我们参照graziano〔1〕的标准以染色强度≥2级为标记表达阳性。
1.4 统计学处理
通过χ2检验，比较三种ne标记表达的相关性与差异，及不同病理类型ne标记表达的差异。
2．结果
2.1 ne标记表达的特征
全组163例nsclc中，cga表达为11.04％，syn为38.65％，ncam为24.54％，神经内分泌肿瘤sclc与tc其ne标记表达明显高于nsclc(见表1)。一般cga多呈灶性染色，较少呈弥散性染色，胞浆内可见特异性染色颗粒，而ncam与syn多呈弥散性染色，syn特异性染色颗粒见于细胞浆，但ncam特异性染色颗粒既可定位于胞膜，也可定位于胞浆。在腺鳞癌，腺癌区域与鳞癌区域ne标记有同时表达，也有非同时表达，有些仅表达于鳞癌区域，而有些只表达于腺癌区域(见图1-5)。
表1 ne标记表达
标记阳性(％)
nsclc(n=163) sclc(n=13) tc(n=7)
ncam 40(24.54) 13(100.00) 7(100.00)
cga 18(11.04) 5(38.46) 4(57.14)
syn 63(38.65) 11(84.61) 6(85.71)
≥1ne标记 77(47.24) 13(100.00) 7(100.00)
≥2ne标记 37(22.70) 11(84.61) 6(85.71)
2.2 3种ne标记表达的一致性
全组nsclc有77例(47.24％)nsclc至少有ⅰ种ne标记表达，37例(22.70％)nsclc至少有2种标记表达，其中30例同时有2种ne标记表达，仅7例3种ne标记均表达。从三种标记表达的关系上看，在18例cga阳性的nsclc中有4例syn无表达，而在63例syn阳性nsclc中有49例cga阴性，经列联表χ2检验，两者表达结果有关(χ2=13.06，p<0.005)，但存在差异(χ2=36.53，p<0.005)；在40例ncam阳性nsclc中有31例cga无表达，而cga阳性组中有9例ncam阴性，两者表达结果有关(χ2=13.36，p<0.005)，但也存在差异(χ2=11.03，p<0.005)；同样在syn阳性组中有35例ncam无表达，而在ncam阳性组中有12例syn阴性，它们的结果有关(χ2=\29.79，\p<0.005)，并且存在差异(χ2=10.30，p<0.005)。说明3种ne标记表达并非完全一致，syn的表达高于ncam，高于cga。从另一侧面观察推测可能cga的特异性较好，而syn的敏感性较好。
2.3 不同病理类型ne标记表达差异
表2 各种组织学类型ne标记表达
组织学类型 n 标记阳性(％)
ncam cga syn ≥1ne标记 ≥2ne标记
鳞癌 76 10(13.16) 8(10.53) 13(17.11) 21(27.63) 8(10.53)
腺癌 62 23(37.10) 8(12.90) 41(66.13) 44(70.97) 25(40.32)
腺鳞癌 21 7(33.33) 2(9.52) 8(38.10) 11(52.38) 4(19.05)
大细胞癌 4 0(0.00) 0(0.00) 1(25.00) 1(25.00) 0(0.00)
合 计 163 40(26.54) 18(11.04) 63(38.65) 77(47.24) 37(22.70)
*χ2检验p<0.05
表2为不同组织学类型ne标记表达情况，除cga外，ncam与syn在不同类型nsclc中的表达存在差异，腺癌的表达高于腺鳞癌、鳞癌、大细胞癌，三种标记的联合检测也存在类似差异。
图1 肺低分化鳞癌示syn弥散性胞浆染色ihc×50;
图2 肺低分化鳞癌示cga局灶性胞浆染色ihc×50；
图3 中度分化腺泡腺癌ncam弥散性胞浆与胞膜染色ihc×50；
图4 高分化乳头状腺癌syn弥散性胞浆染色ihc×50；
图5 腺鳞癌ncam弥散性胞膜与浆染色
3 讨论
3.1 ne标记的选择及其表达
尽管研究ne分化的方法很多，如电镜、ihc、生化测定ne相关的酶及分子生物学通过原位杂交检测编码ne标记的mrna的表达，但是ihc仍然是研究ne分化广泛应用的手段〔2〕。ne标记可分为共同ne标记与细胞特异性标记。共同ne标记有胞质标记、小囊泡相关标记、分泌颗粒相关标记及胞膜标记。这些ne共同标记并非依赖于肿瘤分泌的激素而存在，往往是诊断肿瘤ne表型的第一步，特别是那些不产生和/或分泌激素的肿瘤。细胞特异性标记主要是一些多肽和生物活性胺，它们可以引起特征性的副癌综合症，另一方面也可作为丝裂原或自分泌生长因子促进肿瘤的生长与细胞的分裂。虽然存在如此众多的标记抗原，并且ihc本身技术也不断革新，但一方面抗原或因含量甚微或因以较大的前体分子出现如多肽类激素，使针对这些抗原的抗体敏感性受限，另一方面也因抗原交叉反应使抗体的特异性不够理想。gosney〔3〕的研究显示syn和cga具有较高的特异性与敏感性，addis〔2〕在其述评中补充leu-7可能是其次的选择，但不久会被针对ncam或其它抗原的抗体取代。正因如此，本研究选择上述三种标记cga、syn、ncam运用较敏感的lsab法研究它们在nsclc中的表达。
嗜铬蛋白是一组分子量大小不同的的酸性可溶性蛋白，构成dcg的基质，伴随ne多肽激素出细胞。cga仅是其中之一，由439个氨基酸组成，其编码基因位于14号染色体。有研究显示cga的表达与dcg的出现具有一致性，本实验应用单克隆dak-a3鼠抗，抗原来源于cga羧基端20kda的片段，发现11.04％的nsclc有表达，与文献报道的217％大致相仿〔3～7〕。syn是分子量为38kda的结合膜糖蛋白，为神经元突触前囊泡和正常ne细胞或ne肿瘤细胞的小透明囊泡的成分。由于单克抗隆抗体在2～4小时福尔马林固定的标本中免疫反应明显降低，因此本实验选择syn的多克隆抗体，为生物合成的人syn的兔多抗〔3〕。其表达于38.65％的nsclc，低于loy〔7〕的62％，而比schleusener〔4〕的24.3％，carles〔8〕与sundaresan〔5〕的23％及graziano〔1〕的11.2％要高。ncam属于免疫球蛋白超级家族，是一组密切相关的唾液酸糖蛋白，介导同嗜细胞粘附，在胚胎组织发育过程中起作用。其仅由一个基因编码，定位于11q23，至少有24个外显子组成，通过mrna剪接产生不同异构体，分子大小取决于羧基端的长度。免疫斑点试验发现ncam有3种主要异构体ncama、b、c，分子量大小分别为190kda、135kda、115kda，ncam-a与ncam-b是跨膜糖蛋白，具有不同长度的细胞浆尾巴，而ncam-c通过糖基脂酰肌醇锚着于细胞膜。ncam分子的细胞外部分含有5个免疫球蛋白样结构域及2个纤维连接蛋白ⅲ型同源重复片段，后者连接于胞膜\干区\，根据其所含α-(2，8)多聚唾液酸单位的多少，分为高唾液酸化的ncam-h型，与低唾液酸化的ncam-l型，高唾液酸化可形成碳水化合物屏障，减少接触介导作用，降低细胞粘附力，可能与肿瘤的侵袭行为有关〔9～10〕。ncam在肺癌中表达与肿瘤的ne分化表型相关〔10〕，大部分研究者均选用leu-7单抗，事实上leu-7单抗仅识别ncam的糖基表位，特异性不高，因此本实验选择能识别ncam多肽表位的123c3鼠单抗，定性研究ncam在nsclc中的表达，其抗原来源于新鲜sclc标本的胞膜成分，发现有24.54％的nsclc表达ncam，与文献报道一致〔11～12〕。ncam正常的免疫反应为胞膜呈现特异性染色颗粒，但本实验发现ncam的ihc染色尚出现胞浆染色，推测可能是ncam转运至胞膜的过程有障碍，或ncam的糖基唾液酸化过程障碍，从而导致蛋白的异位储积。精确的抗原定位有待于超微免疫组化技术。
3.2 ne标记表达的相关性与ne分化
尽管文献报道cga、syn、ncam是一组特异性和敏感性较好的ne分化共同标记，并且本研究结果也显示无论是cga与syn、cga与ncam还是syn与ncam之间的表达具有相关性，但是它们的表达并非完全一致，syn的表达高于ncam，高于cga，仅7例nsclc同时3种ne标记均表达，竟然有40例仅表达1种ne标记，其中cga2例，syn28例，ncam10例。说明任何一种ne标记都不是ne分化诊断的完美标记，不能以某一种标记的表达与否作出nsclc的ne分化标准。在cga表达的nsclc中，有88.89％(16/18)与其他两种标记同时表达，而syn为55.56％(35/63)，ncam为75.00％(30/40)，推测可能cga的特异性较好，而syn的敏感性较好。细胞分化是细胞特异性基因组共同协调表达的结果，如此肿瘤存在ne分化应有多种ne分化标记同时表达，因此我们认为应该选择一组ne共同标记联合检测ne分化，cga、syn、ncam可能是目前三种基本的ne标记，并定义两种标记同时表达为ne分化，如此定义有22.70％的nsclc伴ne分化。
3.3 ne分化与组织学类型
不同组织学类型的nsclc出现ne分化的率不同，腺癌高于腺鳞癌、鳞癌、大细胞癌，本研究分别为40.32％、19.05％、10.53％与0.00％，就其原因尚不明确。有研究显示c-src基因表达与sclc的ne分化有关，是否不同类型的nsclc也存在c-src基因表达上的差异，有待进一步研究。但也有不同组织类型伴ne分化无差异的报道〔4〕。
3.4 ne分化与肿瘤起源
长期以来人们一直依据肿瘤细胞的起源组织、细胞形态特征和分化程度对肿瘤进行分型，认为sclc和tc起源于ne细胞,1985年paladugu〔13〕将其与不典型类癌合称为k细胞癌，而nsclc或来自支气管粘液颗粒细胞、基底细胞，或来自细支气管肺泡细胞。但是随着sclc与nsclc细胞系在许多实验室的建立并对其特征的了解，免疫组化技术与分子生物学技术的发展及电子显微镜在肿瘤方面的应用，传统病理学关?quot;肿瘤起源\的观点正面临着挑战，sclc与nsclc都存在明显的异质性，是形态、功能、代谢各异的多种细胞群体的混合物，它们的生物学特性存在明显的重叠，sclc与nsclc都可以出现鳞状分化、腺样分化及ne分化，表现出明显的分化异质性，肿瘤的ne特性并不能反映肿瘤的起源，我们不难看到一些ne分化的未分化小细胞癌也可见于食管、宫颈、膀胱、结肠与前列腺，因此我们赞同一些学者的观点，sclc与nsclc具有共同的细胞起源，可能来自具有多潜能分化特征的支气管上皮干细胞〔14〕。
3.5 nsclc伴ne分化的命名
nsclc伴ne分化曾出现不同的命名，确尾坏湫湍诜置谥琢\、\大细胞神经内分泌肿瘤\、\神经内分泌癌中间细胞型\，但我们认为travis〔15〕的肺神经内分泌肿瘤的分类可能比较合理，其把缺乏光镜表现但可通过免疫组化或电镜明确的nsclc伴ne特征归为ⅱ类肺神经内分泌肿瘤，而把典型类癌、不典型类癌、大细胞神经内分泌癌、sclc归为ⅰ类，它们在光镜下具有器官样、小梁状、栅状或玫瑰花结样ne共同组织结构。
4 结论
选择3种ne标记可以检测出nsclc的ne分化，但不能以某一种标记的表达与否作为nsclc的ne分化诊断，应联合检测以至少2种标记表达定义为ne分化，在不同类型的nsclc中腺癌更易出现ne分化。从肿瘤的ne分化特征来看，sclc与nsclc具有共同的细胞起源，可能来自具有多潜能分化特征的支气管上皮干细胞，伴ne分化的nsclc可从属于肺神经内分泌肿瘤。